单细胞DNA测序要出息了？
单细胞DNA测序要出息了？ by 循因缉药
环球视野，深度视角
单细胞测序，我们一直特指的是scRNA-Seq，很少有提到关于scDNA-Seq，对吧?
除了Mission Bio曾经浮出过水面一段时间，然后就...没有然后了。
其实，并不难理解。
相对RNA而言，对单细胞的基因组进行测序还是太超前了点。
基因组多少数据，转录组多少数据，天渊之别。
不过，有些方向倒是可以讨论。
比如，MissionBio的靶向单细胞DNA测序。
然而，今天我们并不想过多去聊Mission Bio，今天聊的是主要是BioSkryb。
#01
我们不一样
经常做单细胞测序的朋友们都知道，这个活有个很重要的“工序”就是给每个细胞打上标记，避免不同细胞的混淆。
那么，有没有一种可能，我不需要给每个细胞打标记，也能做单细胞测序呢。
（没错，用的就是赛多利斯的CellCelector）
哎，聪明的你肯定想到了，我先把单细胞分出来不就得了。
天才！
BioSkryb也是这么想的。
先用FACS把单细胞分出来，接下来做全基因组（WGA）或者全转录组扩增（WTA），然后建库不就得了？
事实上他们也确实是这么做的。
但是这里带来两个问题：
第一，这种方法的通量显然不高。
第二，要做WGA/WTA难度也不小。
BioSkryb表示我们不一样，解决不了就不解决了。
通量问题以后再考虑，他们着重解决了放大的问题。
BioSkryb既然能在江湖上立下名号，必然有过人之处，他们发明的技术被称之为PTA（Primary Template-Directed Amplification）。
#02
吊打MDA
看了上图，经常做WGA的高手想必已经能看出BioSkryb要表达的意思了。
呃，我没...
后来才理解了，BioSkryb想要表达的是PTA技术在基因组上的覆盖是非常均匀的。
在看这张图，会发现MDA在某些区域会过度扩增，有些地方又覆盖较低。
十分不均匀，厚此薄彼必然不是好老板。
吊打MDA了属于是。
那么，PTA是怎么做到的呢？
其实说简单也并不复杂，简单的说只需要3步。
1变性：首先，DNA样本需要经过变性处理，使双链DNA分开成单链。
2、退火：然后，随机引物（6-9个碱基长度）与单链DNA退火，即引物与DNA模板结合。
3、延伸：使用Phi29 DNA聚合酶和专有的核苷酸池进行延伸反应，生成大约250到1500bp以上长度的扩增子（amplicons）。
由于用的Phi29 DNA聚合酶会持续延伸，直到遇到终止子，并且会把已经延伸出的新链切除。
这就会持续不断的在基因组上扩增出长度不一的序列，并且由于新生成的链被切除后依然会被延伸生成双链。
新链生成后，依然会被Phi29捕获生成双链，但是由于新的双链太短，无法与随机引物结合，因此阻止了扩增子过度扩增的问题。
好家伙，天才~
#03
并非无敌
很显然，PTA技术在WGA上的应用是非常不错的。
但是，如果用在scDNA-Seq上就会瓶颈。
首当其冲的就是通量问题，这表现在两个方面。
第一，单细胞的数量问题。分选出来的细胞数量是有限的，很难做到高通量。
第二，是测序数据量问题。PTA过后的数据是整个基因组，如果要做单碱基突变等后续分析，测序数据量将难以估量。
不过，这么好的技术显然有很多应用方向。
随便举几个例子：
PGT：胚胎植入前筛查。
低起始量建库：比如古法医学啥的，最低起始量可以干到4pg。
CNV/SV：对于这种基因组上均匀扩增的技术，用来做SV结构变异检测显然再好不过，CNV拷贝数变异检测也行。
你还别说，看好CNV检测这块市场的，可不止有BioSkryb。
Mission Bio 2024年9月26日宣布了自己在单细胞拷贝数检测上的最新产品。
只不过，Mission Bio的方案更简单，原先的流程基本没变，就是把靶区域换了换。
在基因组上每相隔5.8Mb左右放一对引物，这样整个人类基因组3Gb大约只需要500多对引物就能拿来算CNV了，算是基因组全覆盖了。
算，我相信也不是不能算，就是与PTA想必优缺点也很明显。
优点是Mission Bio的技术本来就可以高通量的来做scDNA-Seq，并且500多个区域需要的数据量也不高。
缺点是只能做CNV和覆盖区域的SNV检测，不能覆盖整个基因组，并且5.8Mb这个距离并不算近，难免损失精度。
可能正是因为此，BioSkryb也得到了与HCA（Human Cell Atlas）牵手的机会。
#04
最后
那么高通来给你单细胞DNA测序要崛起了吗？
目前BioSkryb和Mission Bio的方案都存在比较大的缺点，只能算是过渡阶段的产品。
当然，这并不妨碍大家用这两家的技术发文章。
甚至，拿他们做个二次开发也不是不行。
其实，高通量单细胞DNA测序还有两个巨大的门槛需要跨越。
第一，极低的测序成本。
如果要充分发挥高通量单细胞DNA测序的威能，至少得做到单细胞WES测序吧，那么目前9.9RMB/G的价格可能远远不够低，华大智造、真迈、赛陆们再努努力。
第二，极低的存储成本。自不必多言了，那时候一个小姐姐的房间可能还放不下你一个样品的数据。
第三，极快的分析速度。同样，存储了还得算吧，这么海量的数据，要是算完都延毕两次了咋整...
最后的最后，HCA看上BioSkryb不会是因为他们加入折扣计划给的优惠太多了吧...
END
啊对对对对，扫描这货
能联系到我
至此，各位股东星标了么？点赞了么？转发了么？在看了么？谢谢！
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相关资料：注1：https://www.bioskryb.com/news/bioskryb-partners-with-human-cell-atlas/注2：https://missionbio.com/press/genome-integrity-assay
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