单个外泌体膜蛋白测序技术：PBA

本次简要介绍一种对单个囊泡的蛋白组学进行定量的技术，文献信息如下：

标题：Profifiling surface proteins on individual exosomes using a proximity barcoding assay

DOI(url): https://doi.org/10.1038/s41467-019-11486-1

日期及杂志：NATURE COMMUNICATIONS Published: 26 August 2019

作者及单位：Di Wu 瑞典乌普萨拉大学生物化学和生物物理系

外泌体与许多生物学过程相关，它们可以作为疾病的重要marker。外泌体膜蛋白携带了其来源组织的信息，由于外泌体的异质性，期望可以研究单个外泌体。本研究中，作者基于抗体-DNA偶联和二代测序，使用 proximity dependent barcoding assay方法对单个囊泡的表面蛋白进行了定量和分析。可以通过外泌体膜蛋白和丰度的不同组合来描述外泌体的不同来源，在混合样本中作为组织特异性相关疾病的markers。

下面这幅图展示了proximity dependent barcoding assay，PBA的基本原理与流程。

首先是PBA 探针制备。该探针为抗体与DNA寡聚核苷酸偶联复合物，抗体为针对各种外泌体表面蛋白的高亲和力、特异性抗体；DNA寡聚核苷酸为一段16个碱基的序列：前8个碱基可以鉴定外泌体膜蛋白的proteinTag，后8个碱基鉴定单个分子的moleculeTag，可以避免后续实验中PCR对定量的影响。

其次是捕获单个外泌体。作者设计了含有标记单个外泌体的complex Tag的15个随机序列环形DNA分子，并通过Roling circle amplification（RCA）获得约几百拷贝的RCA产物。即特定complex Tag序列代表某个外泌体。

接着，外泌体与PBA探针在溶液中混合，然后接种在特定的96孔微量滴定板上，微滴板上有 cholera toxin subunit B (CTB)，可以与与外泌体膜中的GM1神经节苷脂结合从而捕获外泌体。接下来，将RCA产物加入体系中并使其通过互补序列与probes结合。最后通过PCR扩增和建库测序便可读取所有的外泌体上检测到的蛋白含量。

接着作者对这一方法进行了准确度检验。通过STV-生物素-寡核苷酸系统模拟实验，作者使用了四种生物素化寡核苷酸（protein Tag）进行测试。在分开或混合孵育后检测了四种protein Tag与molecule Tag的比例。检测结果与理论相符。

接着又使用CD9和CD63抗体验证PBA准确性。

接着通过PBA分析来自不同来源的单个外泌体的表面蛋白：来自18种不同人类来源（血清、精液、16种细胞系）的外泌体上存在的38种蛋白。在使用3个或3个以上的蛋白分子数据进行降维分析后，作者发现这些蛋白含量差异能在一定程度上区分不同来源的外泌体。

小结

PBA方法仍存在着一些限制：给定蛋白组合的特异性要求很高、测序的覆盖范围和深度要求大，以及需要抗体的选择性和亲和力高。但该方法对检测高异质性的外泌体中特定组分的变化和更有效的对疾病进行早期诊断提供了很好的技术手段。

此外本文的数据fq可以在https://doi.org/10.6084/m9.fifigshare.7956023下载到，定量好的蛋白矩阵也可在https://doi.org/10.6084/m9.fifigshare.7963742下载。